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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，可在田間以及收獲、運輸、加工或儲存期間污染農(nóng)作物。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（糧農(nóng)組織）估計，世界上25％的以作物為基礎(chǔ)的農(nóng)產(chǎn)品會受到真菌毒素污染，導(dǎo)致全球每年大約損失1億噸糧食。玉米赤霉烯酮（ZEN）是鐮刀菌真菌產(chǎn)生的一種類雌激素真菌毒素，是食品和飼料中最常見的真菌毒素之一。ZEN可以激活雌激素受體，會導(dǎo)致農(nóng)場動物的生殖障礙，偶爾也會導(dǎo)致人類出現(xiàn)高雌激素綜合征。因此，ZEN不僅會造成牲畜生產(chǎn)效率較低而引起重大經(jīng)濟損失，而且會對食用受ZEN污染食物的人構(gòu)成健康風(fēng)險。減少ZEN健康風(fēng)險的理想解決方案是避免食品和飼料中的ZEN污染。然而，這在目前的農(nóng)業(yè)實踐卻難以做到。因此，對已經(jīng)被ZEN污染的農(nóng)產(chǎn)品進行解毒處理是另一種不錯的選擇。食品和飼料中ZEN的去除方法包括化學(xué)方法，如將含有ZEN的食品暴露于臭氧或過氧化氫中；物理方法，如擠壓加工；生物方法，如使用生物轉(zhuǎn)化劑將ZEN降解為無毒代謝產(chǎn)物或使用吸附劑降低其生物利用度。 在這些ZEN解毒方法中，生物方法更為可取，因為生物法可以在溫和條件下去除真菌毒素，不必使用有害化學(xué)物質(zhì)，也不會造成食品和飼料營養(yǎng)價值和適口性的重大損失。

zhd101是一種由Clonostachys rosea菌產(chǎn)生的內(nèi)酯酶，它能將ZEN轉(zhuǎn)化為酮類物質(zhì)，這是一種毒性明顯較低的產(chǎn)品。在以前的研究中，zhd101已在大腸桿菌、釀酒酵母和水稻植株中成功表達，由這些轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的重組zhd101可有效降解ZEN。

益生菌一直被用作飼料添加劑，因為它們有使腸道微生物群正�；�，增強免疫系統(tǒng)，預(yù)防腹瀉，提高飼料轉(zhuǎn)化效率等功能。雖然益生菌發(fā)揮了許多有益的作用，但有人推測，它們的特性可以通過遺傳修飾得到進一步改善。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是動物腸道菌群中常見的潛在益生菌之一。Lactobacillus reuteri Pg4最初是從健康肉雞的胃腸道中分離出來的，已被證明能夠耐受酸、鹽和膽汁，抑制病原體生長，并能粘附粘蛋白和粘液。此外，Lactobacillus reuteri Pg4已被用于異源表達一些纖維分解酶，包括β－葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶等。重組Lactobacillus reuteri Pg4菌株已被證明能夠在不損失其益生菌特性的情況下分解纖維。

2017年4月24日，臺灣大學(xué)生物技術(shù)研究所Wen？Chun Yang等人在《Microbial Cell Factories》雜志（IF2017＝3．831，生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)）上發(fā)表了題為“Expression of the Clonostachys rosea lactonohydrolase gene by Lactobacillus reuteri to increase its zearalenone－removing ability”的文章。在該研究中，作者介紹了zhd101基因在Lactobacillus reuteri Pg4中的異源表達，并檢測了重組菌中異源酶的產(chǎn)生、酸和膽鹽耐受性以及粘附能力。

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所用到的主要方法

METHODS

1、反轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－RT－PCR

2、蛋白質(zhì)印記分析－WB

3、高效液相色譜－HPLC

4、耐酸耐膽鹽

5、細(xì)胞粘附性實驗

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

在以前的研究中，本實驗室誘導(dǎo)Lactobacillus reuteri Pg4表達纖維溶解酶，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的Lactobacillus reuteri菌株獲得了分解植物纖維的能力，從而導(dǎo)致肉雞體重增加、飼料轉(zhuǎn)化效率提高。本研究將zhd101基因?qū)�入到Lactobacillus reuteri Pg4中，轉(zhuǎn)化菌株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101成功表達了zhd101，獲得了降解ZEN的能力。據(jù)我們所知，這是第一次報告成功表達ZEN降解酶的腸道乳酸桿菌。

在含有4．5 mg／L ZEN的MRS肉湯中培養(yǎng)3株Lactobacillus reuteri 14小時后，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101肉湯中的ZEN濃度下降了99．3％。Takahashi－Ando等人發(fā)現(xiàn)從大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的重組zhd101在低于4．5的pH值下會發(fā)生不可逆地失活。為此，本實驗在發(fā)酵過程中將Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101培養(yǎng)基的pH值維持在7．0，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101在這種培養(yǎng)條件下可以有效地去除ZEN。這些結(jié)果表明：由Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101產(chǎn)生的重組zhd101在pH7．0下呈活性形式。通常而言，豬小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6．5、6．1和6．5，雞的作物、小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6．1、6．4、6．4和6．6。由于這些動物腸道環(huán)境均呈弱酸性至中性，研究者認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101產(chǎn)生的重組zhd101可以以活性形式直接輸送到腸道。

在之前的一項研究中，我們觀察到Lactobacillus reuteri Pg4在體外對酸性條件和膽汁鹽接觸具有抵抗力。在本研究中，所有三株Lactobacillus reuteri Pg4菌株在pH3．0下培養(yǎng)4小時后或在含有0．5％牛膽的MRS肉湯中培養(yǎng)24小時后均存活。此外，在酸性條件下或膽汁鹽存在下，Lactobacillus reuteri 轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)菌計數(shù)與Lactobacillus reuteri Pg4的細(xì)菌計數(shù)沒有差異。這些結(jié)果表明：Lactobacillus reuteri Pg4菌株可以通過胃運輸存活下來，并可能在腸道環(huán)境中存活，在那里它們可以有效工作。

Caco－2細(xì)胞系已廣泛用于益生菌體外黏附能力的評價。在這項研究中，將熒光標(biāo)記的Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101與Caco－2細(xì)胞孵育2h后，分析顯示Lactobacillus reuteri 細(xì)胞能粘附在Caco－2細(xì)胞上，而目前已證實益生菌可以與致病細(xì)菌競爭腸道上皮細(xì)胞上相同的結(jié)合位點。此外，重組益生菌分泌的特異性酶附著在小腸上皮細(xì)胞上，可直接作用于小腸消化道中的底物，在小腸消化道中可吸收大部分ZEN。因此，Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101粘附腸道粘膜細(xì)胞的能力延長了其在腸道中的停留時間，從而使其達到最大益生菌效果。

總的來說，本實驗成功地在Lactobacillus reuteri 菌株中克隆了水解酶基因zhd101，并檢測確證該異源zhd101可在轉(zhuǎn)化株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101中實現(xiàn)功能性的表達。異源蛋白zhd101的產(chǎn)生并不影響菌株的生長、耐酸耐膽鹽性，對Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101的粘附能力影響較小。因此，我們認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101有可能作為益生菌飼料添加劑用于ZEN的降解。

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