大家好，今天和大家分享的是2020年3月發(fā)表在Mathematical Biosciences and Engineering （IF＝1．285）上的一篇文章：“Screening and validating the immune－related gene expression signatures in peripheral blood mononuclear cells of nonischaemic cardiomyopathy”。作者通過(guò)簡(jiǎn)單的差異基因篩選，富集分析，PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了與非缺血性心肌病中外周血單個(gè)核細(xì)胞失調(diào)相關(guān)的免疫基因表達(dá)以及基因間的聯(lián)系。

Screening and validating the immune－related gene expression signatures in peripheral blood mononuclear cells of nonischaemic cardiomyopathy

非缺血性心肌病外周血單核細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)特征的篩選與驗(yàn)證

一、研究背景

已有大量的證據(jù)表明，激活的免疫反應(yīng)可引起心肌不良的重構(gòu)，而非缺血性心肌病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的失調(diào)也被證實(shí)與患者預(yù)后存在相關(guān)。作者希望在本研究中篩選并驗(yàn)證PBMC的相關(guān)生物標(biāo)志物并探討其影響患者預(yù)后可能的機(jī)制。

二、研究流程

三、結(jié)果解析

1．差異表達(dá)基因篩選

在本研究中，作者使用GEO2R在線分析工具對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中3個(gè)健康樣本和4個(gè)NICM樣本PBMC的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了比較。在對(duì)GSE9128的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，作者共篩選得到371個(gè)DEG（P＜0．05，｜logFC｜≥1，288上調(diào)，83下調(diào)，圖1A）。熱圖中展示了Top10上調(diào)和Top10下調(diào)的DEG的表達(dá)情況（圖1B）。在這371個(gè)DEG中，Top5上調(diào)以及Top5下調(diào)的DEG的相關(guān)信息展示于表1。

圖1A．健康樣本與NICM樣本的DEG；圖1B．Top5上調(diào)和下調(diào)DEG在不同樣本中的表達(dá)情況

表1．Top5上調(diào)／下調(diào)基因的相關(guān)信息

2．GO與KEGG富集分析

為深入了解上述DEG，作者使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)及配套工具進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在生物過(guò)程層面，上調(diào)的DEG主要富集于炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)和翻譯過(guò)程的負(fù)向調(diào)控，而下調(diào)的DEG則富集于基因表達(dá)的晝夜調(diào)節(jié)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的負(fù)調(diào)控、天然免疫反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)和I－κB激酶／NF－κB信號(hào)的負(fù)調(diào)控。對(duì)于細(xì)胞組成來(lái)說(shuō)，上調(diào)的DEG主要富集在胞外外泌體，細(xì)胞核，膜以及核質(zhì)和胞漿中，而下調(diào)的DEG則富集在細(xì)胞核，核質(zhì)，中心體和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物中。在分子功能層面，上調(diào)的DEG主要負(fù)責(zé)ATP結(jié)合、poly（A）RNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合和GTP結(jié)合，而下調(diào)的DEG可能在蛋白質(zhì)結(jié)合、線粒體解偶聯(lián)和細(xì)胞因子活性方面發(fā)揮作用。

為了獲得關(guān)于上述DEG的更多相關(guān)信息，作者還通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了KEGG富集分析（圖2D）。發(fā)現(xiàn)下調(diào)的DEG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、軍團(tuán)菌、NF－κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路中富集，而上調(diào)的DEG在炎癥性腸�。↖BD）、TGF－β信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路和EB病毒感染中富集。

圖2A－C．對(duì)DEG進(jìn)行的GO富集分析結(jié)果展示；圖2D．對(duì)DEG進(jìn)行的KEGG富集分析結(jié)果

3．樞紐基因和代表性模塊的探索

此外，作者通過(guò)Cytoscape軟件分析發(fā)現(xiàn)15個(gè)樞紐基因處于蛋白－蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心位置，這些基因互相存在密切聯(lián)系。作者基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)STRING和上述15個(gè)樞紐基因構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。在這15個(gè)樞紐基因中，只有一個(gè)基因在NICM患者的PBMC中顯著下調(diào)，而其他基因在PBMC中顯著上調(diào)。值得注意的是，JUN不僅是與其它蛋白互作關(guān)系強(qiáng)度最高的DEG，還是fold change最高的下調(diào)DEG。此外，這15個(gè)樞紐基因可以直接與371個(gè)中的149個(gè)DEG相互作用，樞紐基因之間也有相互作用，尤其是JUN和CREB1。此外，作者還使用MCODE插件來(lái)檢測(cè)PPI網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊并確定了評(píng)分值最高的前2個(gè)模塊——模塊1（圖3B）與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的免疫反應(yīng)和蛋白質(zhì)加工有關(guān)，模塊2（圖3C）與炎癥的信號(hào)通路和細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，PPI網(wǎng)絡(luò)表明，上述15個(gè)樞紐基因，特別是JUN和CREB，可能在NICM的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

圖3A．通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行的PPI分析結(jié)果（圖示15個(gè)樞紐基因）；圖3B，C．PPI網(wǎng)絡(luò)中的兩個(gè)評(píng)分最高的功能模塊

4．異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠模型中基因的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確證GSE9128芯片的數(shù)據(jù)并進(jìn)行進(jìn)一步的研究，作者通過(guò)qPCR在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損害的小鼠模型中重新鑒定了Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因（圖4）。qPCR結(jié)果表明，NICM小鼠PBMC中EGR3、MBNL1、PTGS2、EGR2和TXNIP的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0．05），而NICM組GABARAPL3、NPIPB3、RGS1、CREM和JUN的mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0．05），與通過(guò)生信分析得出的DEG結(jié)果相互印證。

圖4．在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損害的小鼠模型中測(cè)定前文中Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的表達(dá)情況

5．探討PBMC亞型中DEG的表達(dá)情況

此外，作者還檢測(cè)了PBMC亞型中Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的mRNA水平。目前已知PBMC主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞。因此，作者主要探討了這10個(gè)基因在CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD14＋單核細(xì)胞和CD20＋B細(xì)胞中的mRNA水平（圖5）。發(fā)現(xiàn)EGR3主要在NICM小鼠T細(xì)胞中表達(dá)。單核細(xì)胞中MBNL、PTGS2和EGR2均較高，而NICM小鼠的表達(dá)明顯較高。TXNIP主要表達(dá)于CD4＋T細(xì)胞，CD8＋T細(xì)胞和CD20＋B細(xì)胞，在NICM存在下其表達(dá)顯著增加。關(guān)于下調(diào)基因，作者發(fā)現(xiàn)JUN在正常受試者的T細(xì)胞中高表達(dá)，而在NICM小鼠的T細(xì)胞中其水平降低，但在B細(xì)胞中增加。CREM主要在T細(xì)胞中表達(dá)，而NICM小鼠T細(xì)胞中CREM水平降低。RGS1主要在正常小鼠的B細(xì)胞中表達(dá)。與NICM小鼠相比，正常小鼠T細(xì)胞和單核細(xì)胞NPIPB3水平較高。四種免疫細(xì)胞中GABARAPL3的mRNA水平在正常小鼠中始終高于NICM小鼠。

圖5．前文篩得的Top5上調(diào)基因和Top5下調(diào)基因的mRNA水平

小結(jié)

       作者將常用于腫瘤學(xué)的DEG篩選、GO和KEGG富集分析以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)等方法應(yīng)用于非缺血性心肌病的相關(guān)研究，并且進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，可以說(shuō)是較為成熟的干濕實(shí)驗(yàn)結(jié)合套路，但作者將前述套路套用到非缺血性心肌病外周血單個(gè)核細(xì)胞失調(diào)的研究中，思路新穎。不過(guò)作者在文章中并未對(duì)某一具體通路進(jìn)行探究，具體的相關(guān)機(jī)制還有很大的挖掘空間。