5．在HPV + TIL中發(fā)現(xiàn)了生發(fā)中心B細胞

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TME中的B細胞與人類腫瘤類型的總體生存呈正相關,并會影響CD4 + Tconv細胞表型。B細胞聚類顯示11個亞群(圖4A),基因集富集分析確定了:生發(fā)中心B細胞(#1-4)、漿細胞(#5)、幼稚細胞(#6和9),記憶細胞(#8和11)(圖4C)。細胞周期富集提示#3和4為暗區(qū)中迅速增殖的B細胞,而#1和2為亮區(qū)的中心細胞,在此處它們會受到CD4 + TFH的選擇。而在HPV–TIL中,僅存在于血漿或早期的B細胞(圖4B)可能與缺乏CD4 + TFH有關(圖3BE)。B細胞的擴散映射圖(圖4DE)顯示了跨多軸分化的復雜過程,可以看到DC1與生發(fā)中心形成有關,DC4與從幼稚到記憶B細胞的過渡有關以及DC3與向漿細胞的發(fā)育相關,其中HPV–TIL和HPV+TIL在DC1上有顯著的差異,提示生發(fā)中心B細胞的顯著差異。生發(fā)中心B細胞存在于HPV+ HNSCC各個發(fā)展階段,而HPV–HNSCC中心B細胞較少,提示HPV + HNSCC可能有更好的預后。

圖4． B細胞分析揭示了生發(fā)中心B細胞和相關的獨特B細胞群體

6．共同的軌跡產(chǎn)生不同的髓系狀態(tài)譜

髓樣細胞有腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)和樹突狀細胞。TAM可以抗腫瘤的M1樣或促腫瘤的M2樣。最近研究表明TME中髓樣細胞之間存在更廣泛的異質(zhì)性,或可共同表達或獨特表達。這里確定了8個髓樣細胞亞群,其中#2-4主要存在于PBMC中,而#1和#5-8主要存在于TIL中(圖5AB)。

#2為CD16 +單核細胞,#3和4為CD14 +單核細胞(CD16+更成熟),且#3的FCGR3A(CD16)表達較低,表明它不是CD14 + CD16 +單核細胞的過渡亞群。#5和7則表達高水平的趨化因子和細胞因子。#1、6和8表達較高的HLA分子(與抗原呈遞細胞一致),但#1的IDO1,CCL17和CCR7表達較高;#6表達CD1C(與常規(guī)樹突狀細胞一致);#8高表達補體相關基因,以及M2相關基因。在HPV–TILs中發(fā)現(xiàn)有更多的#1和8,提示HPV–疾病患者具有潛在的免疫抑制作用。

接著進行擴散圖映射,并確定了幾個分支(圖5DE),#5位于中心,在DC1和DC2軸上的正方向上,#5朝#7和8發(fā)展,提示#7和8為終末分支(圖5EG)。已知補體高表達與未成熟的樹突狀細胞相關,表明促進#8這個樹突狀細胞亞群的成熟可以改善抗腫瘤T細胞反應。(圖5G)

圖5． 髓系細胞在TME中的獨特狀態(tài)和潛在的可塑性

7．免疫細胞之間的crosstalk

單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析不僅可以揭示細胞內(nèi)在信息,還可以通過配體和受體表達來探究可能的細胞外相互作用。為了找到潛在的細胞間相互作用,使用了708種配體和691種受體的list來鑒定配體/受體的表達,這些配體/受體可以形成總共2557個潛在的相互作用對。首先評估了HPV–和HPV + HNSCC中差異表達的配體和受體(圖6AB)。接下來,為了挖掘更大的潛在配體和受體作用,使用自主開發(fā)的R包CellTalker(https://github．com/arc85/celltalker)鑒定免疫譜系內(nèi)部和譜系之間的相互作用。總共鑒定了168個配體和194個受體,它們參與了481個獨特的相互作用,最后用circos圖進行可視化(圖6C-6F)。交互大致分為三種類型:common、unique(與健康供體相比)、unique(與所有其他樣本相比)�？梢钥吹�,與健康人的PBMC和tonsil相比,TIL中的細胞通訊更多。

圖6．HPV–和HPV + TIL之間的受體和配體表達模式不同,并且在TIL中發(fā)生廣泛的細胞間通訊

8．空間組織與轉(zhuǎn)錄特征一致

盡管上一部分的分析從全局的角度揭示了細胞交互,但了解免疫細胞的空間定位將為基于鄰近性推測的細胞間通訊提供更嚴格的論證。所以接下來對同一患者的成對組織切片進行了多光譜免疫熒光(IF)來探索免疫和腫瘤細胞的空間位置,并基于鄰近性確定了可能參與細胞間通訊的免疫亞群。

首先根據(jù)每種免疫細胞在亞群的頻率對每個感興趣區(qū)域(ROI)進行分層聚類(圖7A),揭示了與特定免疫譜系相關的聚類。每張圖像中,使用R包trimesh進行了Delunay三角剖分(Delunay triangulation,一種圖像處理技術),基于鄰近度來識別最可能彼此交互細胞類型。圖7B-7F右圖為一種細胞類型與另一種類型相互作用的對數(shù)比幾率。在B細胞頻率最高的#3和5中,B細胞相互作用幾率最高的是其他B細胞,其次是CD4 + Tconv(圖7D和7F)�；�于空間關系,接下來使用CellTalker來推斷HPV–和HPV + TIL中B細胞和CD4 + Tconv細胞之間交互網(wǎng)絡的差異(圖7G和7H)。與scRNA-seq和IF分析一致,發(fā)現(xiàn)HPV–和HPV + TILs中均有B細胞和CD4 + Tconv細胞的相互作用,但只有HPV + TIL的生發(fā)中心B細胞(cluster B-1至cluster B-4)與TFH(clusterCD4+ -1)之間有相互作用。

接下來,利用來自TCGA的臨床數(shù)據(jù)和bulk mRNA數(shù)據(jù)確定HNSCC中的CD4 + TFH是否與生存相關。與之前發(fā)表的數(shù)據(jù),HPV +患者的預后比HPV -好。然后,根據(jù)來自scRNA-seq數(shù)據(jù)中與TFH相關的差異表達基因評估了患者的TFH基因signature,并根據(jù)TFH評分進行分層以進行單變量PFS分析(圖7I)以及多變量生存分析,高TFH均與較好的預后顯著相關。總的來說,確定了不同組織切片的獨特免疫浸潤模式,并使用CellTalker以及HPV +和HPV-HNSCC中的scRNA-seq數(shù)據(jù)表征了獨特的TFH亞群和生發(fā)中心的相互作用,并發(fā)現(xiàn)TFH富集的轉(zhuǎn)錄特征與更好的預后相關。

圖7． IF分析提供了基于空間定位的推定細胞間通訊信息

小結

本篇學習筆記利用scRNA測序評估了HPV–和HPV + HNSCC患者以及健康供體的外周和腫瘤內(nèi)免疫群體中131,224個單細胞的轉(zhuǎn)錄譜,轉(zhuǎn)錄組結果通過多光譜免疫熒光分析和基于空間鄰近性來推測細胞交互來進行背景分析。發(fā)現(xiàn)了HPV–和HPV + HNSCC免疫譜系之間的差異,這些結果對免疫療法的設計將產(chǎn)生重要的影響,相似的免疫譜系(CD8 + T之間和CD4 + Treg之間)靶向療法可能差異不大,而針對不同的免疫譜系(即CD4 + Tconv細胞,B細胞和髓樣細胞)的免疫療法則較為多變。

這篇學習筆記有很多亮點,首先新開發(fā)的三種算法:DRAGON:基于熱學知識進行聚類、SingleSetGset進行基因集富集測試、CellTalker用于推斷細胞交互;其次是研究主題更有轉(zhuǎn)化意義,一般來說很多都是研究不同分子分型之間的差異,而這篇學習筆記著眼于病因差異研究,更容易在臨床上進行判斷;然后研究內(nèi)容比較豐富,不僅基于單細胞測序信息分析了特定免疫譜系的亞群狀態(tài),還分析了細胞間通訊和細胞鄰近性關系。最后是研究中的統(tǒng)計學分析也很嚴謹,不僅在鑒定差異基因用了事后功效分析,在細胞聚類也用其進行統(tǒng)計學驗證。在比較免疫譜系差異時,也較新穎地使用了巴氏距離來量化差異。